近日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組在Genome Biology（《基因組生物學(xué)》）發(fā)表了題為“Doxycycline-dependent Cas9-expressing pig resources for conditional in vivo gene nullification and activation”的研究論文，該研究構(gòu)建了可通過小分子藥物靈活調(diào)控基因剪刀蛋白Cas9表達(dá)的工具豬，利用該工具模型，實(shí)現(xiàn)了成體大動(dòng)物體內(nèi)高效基因編輯，并首次構(gòu)建了大動(dòng)物原發(fā)性可轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌模型。

　　豬不僅是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是重要的醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，特別是CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)，越來越多具有重要應(yīng)用價(jià)值的基因修飾豬模型被培育出來。構(gòu)建這些模型主要通過受精卵注射或體細(xì)胞核移植技術(shù)來實(shí)現(xiàn)。然而，通過受精卵注射方式獲得的基因編輯動(dòng)物往往是嵌合體，需通過進(jìn)一步的繁殖才能獲得目標(biāo)基因型，通過體細(xì)胞核移植方式獲得基因編輯動(dòng)物涉及復(fù)雜、低效的體細(xì)胞克隆過程，耗時(shí)、耗力且成本極高。

　　為了解決以上問題，賴良學(xué)課題組多年來一直致力于培育嵌入基因剪刀（Cas9蛋白）的工具豬模型，早在2017年，培育出了以Cre重組酶為開關(guān)來啟動(dòng)Cas9蛋白表達(dá)的工具豬，首次實(shí)現(xiàn)了對(duì)成體大動(dòng)物直接進(jìn)行體內(nèi)基因編輯，并將其成功地用于原發(fā)性肺癌模型的建立（Genome Research, 2017）。但該工具豬模型的應(yīng)用需要在體內(nèi)遞送入Cre重組酶，其過程復(fù)雜、昂貴，且效率較低。另外，Cre重組酶對(duì)Cas9蛋白表達(dá)的啟動(dòng)是永久性的，而Cas9蛋白在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)，會(huì)引起基因組損傷、脫靶效應(yīng)及免疫反應(yīng)等不利影響。

　　四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)可通過簡(jiǎn)單的小分子藥物Dox靈活地調(diào)控外源基因的表達(dá)時(shí)間與表達(dá)量，且具有簡(jiǎn)單、高效及易操作的特點(diǎn)。2022年，賴良學(xué)課題組通過基因編輯技術(shù)將該調(diào)控系統(tǒng)引入豬體內(nèi)，培育出了Dox誘導(dǎo)外源基因表達(dá)工具豬模型，并證明了其對(duì)任意外源基因的可調(diào)控表達(dá)的有效性（Science China Life Sciences, 2022）。在本次研究成果中，研究人員進(jìn)一步將Dox誘導(dǎo)外源基因表達(dá)系統(tǒng)和Cas9蛋白一起嵌入豬體內(nèi)，培育出了帶有升級(jí)版基因剪刀的工具豬。

　　研究人員首先證實(shí)，小分子藥物可對(duì)工具豬體內(nèi)的Cas9蛋白表達(dá)時(shí)間和表達(dá)劑量加以靈活調(diào)控，即Cas9表達(dá)由藥物施用與撤除而加以啟動(dòng)和關(guān)閉，而表達(dá)量受給藥劑量控制。另外，通過對(duì)懷孕母豬進(jìn)行藥物處理，小分子藥物Dox可跨過胎盤屏障，實(shí)現(xiàn)胎兒體內(nèi)剪刀蛋白Cas9的高效誘導(dǎo)表達(dá)。接著，研究人員進(jìn)一步證實(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)的剪刀蛋白Cas9不僅可以切割基因組，導(dǎo)致基因失活及染色體重排，還可以采用截短失活型sgRNA及轉(zhuǎn)錄激活蛋白組合，實(shí)現(xiàn)內(nèi)源靶標(biāo)基因的表達(dá)激活。

　　為了驗(yàn)證利用該工具模型進(jìn)行體內(nèi)基因編輯的效果，研究人員將包裝有靶向兩個(gè)抑癌基因（TP53、LKB1）的sgRNAs和人KRASG12D表達(dá)框的腺相關(guān)病毒通過胰腺導(dǎo)管和/或直接胰體注射至胰腺內(nèi)，誘導(dǎo)產(chǎn)生致癌基因突變。21周后，豬出現(xiàn)明顯的腹脹和攝食減少，PET-CT結(jié)果顯示腹腔內(nèi)出現(xiàn)明顯的代謝信號(hào)異常，解剖結(jié)果顯示，胰腺內(nèi)出現(xiàn)大量腫瘤，并且已轉(zhuǎn)移至肝臟、腸及膈膜等器官/組織，組織切片結(jié)果也顯示出現(xiàn)了典型的胰腺導(dǎo)管腺癌病理變化。

　　研究團(tuán)隊(duì)獲得的Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)豬模型，將為直接進(jìn)行體內(nèi)基因編輯、體內(nèi)基因文庫篩選及體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控提供理想的工具。

　　另外，研究人員還在該工具基礎(chǔ)上，通過時(shí)空調(diào)控Cas9表達(dá)，建立了一步體細(xì)胞克隆法即可獲得能夠穩(wěn)定遺傳的時(shí)空特異性單或多基因敲除豬模型的策略，為后續(xù)構(gòu)建各種用途的新型條件性基因敲除豬模型提供了極大便利，也為細(xì)胞譜系示蹤模型構(gòu)建、基因治療過程中Cas9蛋白的安全性評(píng)估等研究提供理想的工具。

　　本研究中，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組金琴副研究員、劉曉藝博士研究生、莊鎮(zhèn)鵬博士研究生以及廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所黃家園博士為共同第一作者，賴良學(xué)研究員和王可品研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、海南省重大科技計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)和中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程等項(xiàng)目的資助。

　　論文鏈接

　　Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)工具豬模型培育與應(yīng)用

　　（A）Dox誘導(dǎo)Cas9蛋白表達(dá)原理圖；（B）原代Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)工具豬照片；（C）基于Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)工具豬構(gòu)建原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌模型示意圖；（D）原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌及其轉(zhuǎn)移器官/組織照片；（E）Dox誘導(dǎo)Cas9表達(dá)工具豬的應(yīng)用領(lǐng)域