近日，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組在Science China Life Sciences在線發(fā)表了題為Double knock-in pig models with elements of binary Tet-On and phiC31 integrase systems for controllable and switchable gene expression的研究論文，這項(xiàng)研究成功建立了僅需一輪體細(xì)胞克隆，即可獲得可穩(wěn)定遺傳的藥物調(diào)控外源基因表達(dá)的工具豬模型。 

　　高表達(dá)外源基因的基因修飾豬在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。在豬體內(nèi)引入可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，可以對(duì)外源基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)的時(shí)空調(diào)控，有利于基因功能的深入剖析和拓展基因修飾豬的應(yīng)用范圍。長(zhǎng)期以來(lái)，由于技術(shù)困難，穩(wěn)定、高效的可誘導(dǎo)表達(dá)外源基因工具豬模型一直未能建立。隨著基因編輯技術(shù)的快速發(fā)展，高效構(gòu)建各種類型的基因突變，包括單基因敲入、單或多基因敲除/點(diǎn)突變的基因修飾豬模型成為可能，這為在豬上構(gòu)建穩(wěn)定可靠的可誘導(dǎo)基因表達(dá)體系提供了技術(shù)保障。 

　　在研究過(guò)程中，該團(tuán)隊(duì)首先采用雙位點(diǎn)定點(diǎn)敲入的策略，借助兩種不同的抗性基因表達(dá)盒進(jìn)行細(xì)胞篩選之后，結(jié)合體細(xì)胞克隆獲得了四環(huán)素（Dox）誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)的工具豬模型。 

　　為了提高后續(xù)獲得Dox誘導(dǎo)其它基因表達(dá)豬模型的效率，在報(bào)告基因兩側(cè)引入了能被PhiC31重組酶識(shí)別的attP位點(diǎn)。在細(xì)胞以及克隆胚胎水平均能實(shí)現(xiàn)PhiC31介導(dǎo)的基因表達(dá)盒式置換，獲得Dox誘導(dǎo)其它任意基因的基因修飾豬細(xì)胞，由此繞過(guò)復(fù)雜而又低效的傳統(tǒng)基因敲入步驟。據(jù)此，該團(tuán)隊(duì)建立了過(guò)表達(dá)EGFP、hKRAS^G12D及OSKM的豬細(xì)胞系。 

　　原癌基因KRAS^G12D突變是腫瘤病人中最常見(jiàn)的突變類型之一，條件性表達(dá)KRAS^G12D的動(dòng)物模型在腫瘤研究中占有重要的作用。利用前述Dox誘導(dǎo)基因表達(dá)豬模型，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步建立了Dox誘導(dǎo)hKRAS^G12D（DIK）表達(dá)的豬品系。對(duì)從DIK豬分離獲得的耳朵成纖維細(xì)胞及胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行Dox誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后成纖維細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力，提示了其轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞的潛力。接著對(duì)7月齡的DIK豬進(jìn)行長(zhǎng)期的體內(nèi)Dox誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，在誘導(dǎo)后第8個(gè)月左右，DIK豬鼻子、口腔、陰囊部位出現(xiàn)腫瘤樣增生，腫瘤樣品表達(dá)鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)志物CK5/6、CK18。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明，不同部位腫瘤樣品間具有更相似的基因表達(dá)譜；GO分析富集到了細(xì)胞遷移、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期、細(xì)胞群體增殖和細(xì)胞通訊等生物過(guò)程；KEGG通路分析表明代謝及腫瘤等信號(hào)通路發(fā)生改變；Ras信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，許多活化Ras的下游效應(yīng)蛋白，例如AFDN、PIK3CB、RASSF5、TIAM1、RIN1、RALBP1、RAPGEF5、PIK3R2和RALGDS均顯著上調(diào)。綜上，Dox誘導(dǎo)hKRAS^G12D表達(dá)可以驅(qū)動(dòng)DIK豬體內(nèi)腫瘤發(fā)生，DIK豬品系是腫瘤生物學(xué)研究的有力工具。 

　　此外，可誘導(dǎo)表達(dá)外源基因工具豬，也是一種寶貴的基因資源，為后續(xù)建立各種用途的豬模型提供了極大便利。雙位點(diǎn)敲入豬遵循孟德?tīng)栠z傳定律，將Dox誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)豬與野生型豬交配擴(kuò)繁，可獲得四種不同基因型(Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}, Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}, Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT和Rosa26^WT/WTHipp11^WT/WT）后代。例如，對(duì)于Rosa26^rtTA/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型豬，可以將細(xì)胞水平的重組酶介導(dǎo)的基因盒式置換與體細(xì)胞核移植相結(jié)合，培育Dox誘導(dǎo)目的基因表達(dá)豬模型；鑒于體細(xì)胞核移植低效且昂貴，而基因盒式置換在胚胎中非常高效，因此，也可以采用將phiC31 mRNA和供體DNA直接注射到源自Dox誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)豬群的受精卵的方法培育Dox誘導(dǎo)目的基因表達(dá)豬；對(duì)于Rosa26^WT/WTHipp11^{TRE3G-tdTomato/WT}基因型豬，可以通過(guò)由組織特異性啟動(dòng)子控制的rtTA元件的單位點(diǎn)敲入，培育可用于譜系追蹤的組織特異性誘導(dǎo)報(bào)告基因表達(dá)豬模型；類似地，對(duì)于Rosa26^rtTA/WTHipp11^WT/WT基因型，可以通過(guò)單位點(diǎn)敲入TRE3G驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)盒，培育Dox誘導(dǎo)表達(dá)豬品系。 

　　本研究中，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組金琴博士為第一作者，賴良學(xué)研究員和王可品副研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省科技計(jì)劃、海南省重大科技計(jì)劃、中國(guó)科學(xué)院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)和中國(guó)科協(xié)青年人才托舉工程等項(xiàng)目的資助。 

　　論文鏈接

　　可誘導(dǎo)外源基因表達(dá)工具豬的應(yīng)用