基因表達調(diào)控是決定細胞命運的重要因素，通過改變基因的表達模式即可實現(xiàn)對細胞命運的精準調(diào)控。比如運用Yamanaka四個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc）在體外就可將體細胞成功重編程為誘導多能干細胞。2020年6月10日，中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院/廣州再生醫(yī)學與健康廣東省實驗室姚紅杰課題組聯(lián)合清華大學生命科學學院孫前文課題組在國際學術期刊Science Advances在線發(fā)表了題為R-loops Coordinate with SOX2 in Regulating Reprogramming to Pluripotency的研究論文，該研究成果揭示了SOX2/Ddx5與R-loop協(xié)同調(diào)控體細胞重編程的新機制。 

　　在基因轉(zhuǎn)錄過程中，會形成一種由單鏈DNA和DNA:RNA雜合鏈組成的三鏈核酸結(jié)構(gòu)，稱為R-loop。R-loop廣泛存在于各個物種中，最早被認為是轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，但近年來發(fā)現(xiàn)R-loop在很多生物學過程中發(fā)揮著重要的作用。已有研究報道R-loop相關蛋白很多都是RNA結(jié)合蛋白（RBP），然而RBP如何協(xié)同R-loop在細胞命運決定中發(fā)揮作用尚不清楚。早在2017年，姚紅杰課題組在國際學術期刊Cell Stem Cell已經(jīng)揭示了RBP Ddx5通過調(diào)節(jié)miR-125b代謝從而負向調(diào)控PRC1復合物的非經(jīng)典亞基RING1和YY1結(jié)合蛋白（RYBP）的雙重功能，進而調(diào)控體細胞重編程為誘導多能干細胞。但是Ddx5作為RNA解旋酶在體細胞重編程中的功能仍然未知。 

　　研究團隊運用ssDRIP-seq技術，首先繪制了體細胞重編程過程中R-loop的動態(tài)變化圖譜，發(fā)現(xiàn)R-loop并不是簡單地作為轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物出現(xiàn)，而是在轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化之前就開始變化。根據(jù)R-loop的分布特點，結(jié)合多組學分析發(fā)現(xiàn)R-loop變化與染色質(zhì)開放程度及增強子活性存在很高的正相關性，并與體細胞重編程過程密切相關。研究人員發(fā)現(xiàn)敲降R-loop的重要調(diào)控蛋白RNaseH1的表達可抑制體細胞重編程的進程。為了研究R-loop與體細胞重編程的關系，研究人員構(gòu)建了RNaseH1突變體。體外實驗表明RNaseH1酶活位點單個氨基酸的點突變體（RNaseH1^D209N）可以顯著抑制野生型RNaseH1對R-loop的消解作用。重編程實驗表明RNaseH1^D209N可以改變R-loop水平進而影響體細胞重編程的進程。 

　　因子篩選實驗表明Yamanaka四因子中只有Sox2可以回復因R-loop改變而被抑制的重編程。與對照組相比，過表達Sox2處理組中重編程細胞的R-loop水平更高。結(jié)合組學數(shù)據(jù)及生物信息分析發(fā)現(xiàn)Sox2結(jié)合位點附近的R-loop水平較高，而且在重編程過程中增加Sox2的表達量可以增加相關位點R-loop水平。結(jié)合RNA-seq及ssDRIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Sox2促進多能性基因相關位點的R-loop富集。進一步生物信息分析發(fā)現(xiàn)Sox2調(diào)控的R-loop更傾向位于基因的啟動子區(qū)域。  

　　研究發(fā)現(xiàn)雖然Sox2可以與R-loop形成復合物，但EMSA實驗結(jié)果表明Sox2并不具有直接結(jié)合R-loop的能力，而是間接參與調(diào)控R-loop水平的變化。為了揭示Sox2與R-loop的調(diào)控關系，研究人員通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)Sox2與RNA解旋酶Ddx5存在相互作用。體外R-loop消解實驗揭示Ddx5解旋酶可以直接消解R-loop，而Sox2與Ddx5相互作用并抑制DDX5對R-loop的消解作用。研究還發(fā)現(xiàn)Sox2通過其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（HMG區(qū)域）抑制Ddx5對R-loop的消解作用。 

　　該研究進一步發(fā)現(xiàn)Sox2這一新功能并不依賴于Sox2的轉(zhuǎn)錄因子活性。體細胞重編程實驗發(fā)現(xiàn)Sox2可回復因Ddx5而被抑制的重編程進程以及上調(diào)Ddx5相關調(diào)控位點的R-loop水平，進而促進體細胞重編程為多能干細胞。這項研究發(fā)現(xiàn)了Sox2/Ddx5協(xié)同調(diào)控R-loop參與體細胞重編程過程，闡明了R-loop對細胞命運調(diào)控的重要作用，并揭示了Sox2這一傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子的新功能。

　　中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院/廣州再生醫(yī)學與健康廣東省實驗室姚紅杰研究員與清華大學生命科學學院孫前文研究員為本文的共同通訊作者。姚紅杰課題組博士生李堯益、宋亞威和孫前文課題組博士后徐煒、博士生李沁為本文共同第一作者。該課題的實施得到了來自中國科學院生物物理研究所薛愿超研究員和德國馬普協(xié)會分子醫(yī)學研究所Hans Scholer研究員的幫助。該工作得到來自國家重點研發(fā)計劃干細胞專項、國家杰出青年科學基金、中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、廣州再生醫(yī)學與健康廣東省實驗室、清華-北大生命科學聯(lián)合中心等項目經(jīng)費的支持。 

　　論文鏈接

　　圖1. R-loop水平變化影響體細胞重編程。 

　　圖2. Sox2/Ddx5協(xié)同調(diào)控R-loop。 

　　圖3. 本研究的模式圖。