生命作為自然最美的杰作,其誕生過程令人著迷。在早期胚胎發(fā)育階段,受精卵通過細胞增殖和細胞分化形成囊胚;囊胚在子宮著床后經(jīng)過原腸運動(Gastrulation)形成外、中、內三個胚層。外胚層將發(fā)育成機體的神經(jīng)、皮膚等組織,中胚層將發(fā)育成心臟、血液、肌肉和骨骼等組織,而內胚層則發(fā)育成肺、肝、胰腺和腸等內臟器官。因此,外、中、內三胚層的形成過程對于胚胎發(fā)育的正常進行十分重要,并影響胎兒是否能夠順利從母體誕生。正如英國著名發(fā)育生物學家Lewis Wolpert所說:“人生最重要的階段不是出生和結婚,甚至不是死亡,而是原腸運動?！痹c運動在進化上非常保守,其機制受到精細而嚴謹?shù)恼{控,是最為引人入勝的發(fā)育生物學過程。

　　通過經(jīng)典的細胞標記移植和譜系追蹤等方法,發(fā)育生物學家在上世紀八九十年代已經(jīng)初步建立了小鼠胚胎的細胞命運圖譜。這些研究發(fā)現(xiàn),細胞的空間位置對于細胞命運具有重要的影響。例如,各胚層的前體細胞在原腸胚形成之前的上胚層中具有特定的空間區(qū)域,而當原腸運動完成后,前端外胚層細胞將按照頭尾(Cranio-caudal)的次序,發(fā)育為大腦及脊髓等具有嚴謹前后次序的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。然而小鼠早期胚胎發(fā)育、特別是原腸運動時期的胚層譜系建立及細胞命運決定的分子機制尚不清晰,亟需從時間和空間尺度,在全基因組層面闡釋其調控關系。

　　隨著單細胞轉錄組測序技術的迅猛發(fā)展,傳統(tǒng)上快速動態(tài)變化的胚胎發(fā)育過程,獲得了類似于分子顯微鏡一樣的利器。借助單細胞轉錄組測序,多篇針對原腸運動期間細胞命運決定的工作陸續(xù)在Nature雜志上發(fā)表,形成研究熱點。例如John C. Marioni和Berthold Gottgens實驗室合作,構建了小鼠原腸運動(E6.5)到器官發(fā)生早期階段(E8.5)的細胞命運變化路徑(Pijuan-Sala et al., 2019);同時發(fā)表的另一項工作(Cao et al., 2019)研究了小鼠器官發(fā)生階段(E9.5-E13.5)的單細胞轉錄組情況,鑒定出56種胚胎細胞的發(fā)育軌跡;隨后Anna-Katerina Hadjantonakis和Dana Pe’er實驗室共同在單細胞轉錄組水平上解析了內胚層細胞的發(fā)育路徑(Nowotschin et al., 2019);Chan等結合基因編輯技術進行譜系示蹤,揭示了原腸運動期間的譜系轉換,證實內胚層具有兩重起源,分別來自胚外部分和胚胎部分(Chan et al., 2019)。

　　雖然單細胞轉錄組分析可以重建胚胎細胞的發(fā)育軌跡,但缺乏真實的空間信息,無法將發(fā)育調控過程中的時間和空間信息聯(lián)合分析,而細胞在早期胚胎中的空間位置對其發(fā)育分化命運又是至關重要的。為解決這一難題,景乃禾課題組及其合作團隊多年來在這一領域深耕,建立了一種基于激光顯微切割的低起始量空間轉錄組分析方法(Geo-seq)(Chen et al., 2017),并首先完成了原腸運動中期外胚層的三維空間分子圖譜(Peng et al., 2016)，進一步利用該技術對小鼠早期胚胎發(fā)育多個時期(E5.5、E6.0、E6.5、E7.0和E7.5)的外、中、內三個胚層構建空間轉錄組,建立起百科全書式全基因組的時空表達數(shù)據(jù)庫(http://egastrulation.sibcb.ac.cn/)。此數(shù)據(jù)庫實現(xiàn)了小鼠早期胚胎所有表達基因高分辨率的數(shù)字化原位雜交圖譜,可供其他研究者查詢和分析基因的三維表達模式、共表達關系以及根據(jù)特征表達模式檢索基因等。這是目前國際上關于小鼠原腸運動時期最全面、最完整的交互性時空轉錄組數(shù)據(jù)庫。

　　  圖1. Geo-seq樣品收集示意圖和二維數(shù)據(jù)可視化(corn-plot)

　　Geo-seq收取E5.5-E7.5五個時期的上胚層/外胚層和內胚層,收取E7.0和E7.5時期的中胚層。根據(jù)胚胎大小和胚胎結構的復雜程度,分不同區(qū)域收取。對三維空間轉錄的基因表達進行平面化展示,構建corn-plot。紅色代表高表達,不同的點代表不同的樣品。

　　為揭示不同時期、不同空間位置的胚胎細胞在胚層譜系上的聯(lián)系,研究人員借鑒更具生物學意義、更加穩(wěn)健的SCENIC數(shù)據(jù)分析方法(Aibar et al., 2017),結合著床前胚胎的轉錄組數(shù)據(jù),將發(fā)育過程中最重要的時間和空間信息聯(lián)合分析,構建了小鼠早期胚胎發(fā)育過程的系統(tǒng)發(fā)生樹,并從分子層面重構了胚層譜系的發(fā)生過程。發(fā)育生物學的傳統(tǒng)觀點認為,內胚層主要由原腸運動過程中原條遷移出來的細胞構成。而這一研究的最新發(fā)現(xiàn)是,內胚層細胞可能很早就發(fā)生細胞命運特化,三胚層譜系建成時的內胚層與原始內胚層之間存在更緊密的聯(lián)系。同時發(fā)現(xiàn),部分外胚層和中胚層具有共同的前體細胞。這將指導發(fā)育生物學研究人員進一步通過譜系追蹤等遺傳學方法,研究胚層譜系建立和細胞命運決定,促進干細胞生物學研究人員對神經(jīng)外胚層多能干細胞的研究,完善體外肝細胞、胰島B細胞和脊髓神經(jīng)細胞等器官前體細胞的分化體系,推動細胞治療和藥物篩選工作的發(fā)展。

　　 圖2. E2.5時期到E7.5時期的空間結構域相似性

　　不同時期的顏色條代表基因表達結構域,MOR-桑椹胚,ICM-內細胞團,Epi-上胚層,PrE-原始內胚層,En-內胚層,E1-內胚層基因表達結構域1,Ect-外胚層,PS-原條,M-中胚層,MA-前端中胚層,MP-后端中胚層。計算結構域之間的相關性,連接線的粗細表示相對相關性大小。

　　為了探索胚層譜系建立過程中的關鍵信號分子,研究者進行了信號通路富集分析。結合功能實驗,首次發(fā)現(xiàn)Hippo/Yap信號通路在內胚層譜系發(fā)生過程中具有重要作用。同時也找到了許多在胚層譜系發(fā)生過程中關鍵的轉錄因子。這項工作系統(tǒng)全面地繪制了早期胚胎發(fā)育過程中,譜系建立的關鍵信號調控網(wǎng)絡,這將大大推動發(fā)育生物學和干細胞生物學對細胞命運抉擇的認識,加深對生命運行機制的理解。

　　 圖3. 胚層關鍵信號作用區(qū)域及關鍵轉錄因子調控網(wǎng)絡

　　繪制了小鼠胚胎E5.5-E7.5時期外、中、內三胚層的關鍵信號通路作用區(qū)域;不同顏色代表不同組的轉錄因子;棕色連接線代表正相關,綠色連接線代表負相關,連接線的粗細代表相關程度;MGI數(shù)據(jù)庫中敲除小鼠表型與原腸運動異常的標注為三角符號。

　　本研究主要由中國科學院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心/生物化學與細胞生物學研究所景乃禾課題組、中國科學院-馬普學會計算生物學伙伴研究所韓敬東課題組與中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦課題組共同合作完成,中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦研究員、中科院馬普計算生物研究所索生寶博士、生物化學與細胞生物學研究所的崔桂忠博士和禹方博士為該論文的共同第一作者,景乃禾研究員、韓敬東研究員和彭廣敦研究員為該論文的共同通訊作者。該工作得到了中國科學院動物研究所周琪研究員、悉尼大學Patrick P.L. Tam教授、生化與細胞所化學生物學技術平臺、高性能計算存儲與網(wǎng)絡服務平臺和動物實驗技術平臺的大力支持。這項工作得到了中國科學院戰(zhàn)略性先導科技專項、國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委員會、廣東省科學技術基金、廣州再生醫(yī)學與健康廣東省實驗室前沿探索項目、上海市自然科學基金和上海市科學技術委員會的資助。

　　Reference:

　　1. Aibar, S., Gonzalez-Blas, C.B., Moerman, T., Huynh-Thu, V.A., Imrichova, H., Hulselmans, G., Rambow, F., Marine, J.C., Geurts, P., Aerts, J., et al. (2017). SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature methods.

　　2. Cao, J., Spielmann, M., Qiu, X., Huang, X., Ibrahim, D.M., Hill, A.J., Zhang, F., Mundlos, S., Christiansen, L., Steemers, F.J., et al. (2019). The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis. Nature.

　　3. Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S., Kretzmer, H., Norman, T.M., Adamson, B., Jost, M., Quinn, J.J., Yang, D., Jones, M.G., et al. (2019). Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature.

　　4. Chen, J., Suo, S., Tam, P.P., Han, J.J., Peng, G., and Jing, N. (2017). Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq. Nature protocols 12, 566-580.

　　5. Nowotschin, S., Setty, M., Kuo, Y.Y., Liu, V., Garg, V., Sharma, R., Simon, C.S., Saiz, N., Gardner, R., Boutet, S.C., et al. (2019). The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature.

　　6. Peng, G., Suo, S., Chen, J., Chen, W., Liu, C., Yu, F., Wang, R., Chen, S., Sun, N., Cui, G., et al. (2016). Spatial Transcriptome for the Molecular Annotation of Lineage Fates and Cell Identity in Mid-gastrula Mouse Embryo. Developmental cell 36, 681-697.

　　7. Pijuan-Sala, B., Griffiths, J.A., Guibentif, C., Hiscock, T.W., Jawaid, W., Calero-Nieto, F.J., Mulas, C., Ibarra-Soria, X., Tyser, R.C.V., Ho, D.L.L., et al. (2019). A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis. Nature.